Фолдинг метод в теории групп. Фолдинг белка

Первичная структура белка формируется в результате трансляции белка. По окончании трансляции процесс образования белка не завер- шается. Пептидная цепь претерпевает пространственные изменения, приводящие к ее сворачиванию в правильную трехмерную структуру. Этот процесс является следующим этапом формирования белка и назы- вается фолдингом. Фолдинг включает процессы образования вторичной, третичной и четвертичной структур белка. Фолдинг совершается не одномоментно, а в несколько стадий. Согласно схеме, предложенной О.Б. Птициным (1972г.) он включает следующие этапы:

Случайный белок – пептидная цепь в первичной структуре сразу после трансляции свернута в рыхлый клубок. Все связи между аминокислотными остатками (кроме пептидной) отсутствуют. Такая цепь обладает эластичностью: растягивание ее требует приложения силы, после завершения действия силы цепь возвращается в состоянии клубка.

Предшественник расплавленной глобулы – происходит форми- рование неполной вторичной структуры, за счет взаимодействия всех функционально активных групп аминокислот, кроме радикалов. Цепь принимает определенную пространственную структуру, но частично развер- нута.

Расплавленная глобула – вторичная структура сформирована; на- чинается сжатие цепи в компактную глобулу за счет взаимодействий между радикалами, но окончательно сформированных связей еще нет. Радикалы взаимодействуют с «кем попало», выбирая наиболее правильные позиции. Конфигурация глобулы неустойчива. Жесткой третичной структуры еще нет.

Нативный белок – связи в расплавленной глобуле установились: ра-

дикалыобразовали максимально возможное количество связей: белок нахо- дит оптимально выгодную структуру.

У олигомерных белков фолдинг завершает связывание протомеров в олигомеры.

По времени фолдинг одних белков начинается на стадии трансляции синтеза белка и проходит по мере его роста на рибосоме. Такой фолдинг называется ко-трансляционным. Для других он начинается после завершения трансляции и называется посттрансляционным.

Фолдинг небольших молекул белка определяется первичной структурой данного белка, то есть, последовательностью аминокислот в пептидной цепи, на основе только физико-химических взаимодействий своих химических групп (в частности радикалов). Это подтверждается экспериментом с рибонуклеазой, проведенным К. Анфинсеном в 1973г.

Рибонуклеаза – глобулярный белок, расщепляющий связи между нуклеотидами в РНК. Он состоит из 124 аминокислот, среди которых 8 остатков цистеина образуют 4 дисульфидные связи: 26-84; 40-95; 58-110 и 65-72 (цифры указывают номер остатков цистеина в цепи) (рис.32).

Рис.32. Денатурация и ренативация рибонуклеазы. А – нативная молекула рибонуклеазы, в третичной структуре которой имеются 4 дисульфидные связи; Б – денатурированная молекула рибонуклеазы; В – нативная молекула рибонулеазы, в структуре которой вновь образованы 4 дисульфидные связи между теми же остатками цистеина

Если в среду с рибонуклеазой внести мочевину, (разрывающую водородные связи) и β-меркаптоэтанол (разрывающий дисульфидные связи), то глобулярная нативная структура белка разрушается (денатурация ) и пептидная цепь образует случайный клубок – случайным образом свернутая пептидная цепь в первичной структуре. Ферментативная активность исчезает в связи с разрушением активного центра; белок находится в состоянии, какое он имел до фолдинга. Затем, если оба агента удалить из среды, то восстанавливается нативная структура и фермен- тативная активность белка. Таким образом, происходит ренатурация (восстановление денатурированной структуры белка), ренативация или рефолдинг . Следовательно, строго определенная конформация белка заключена в первичной структуре и для небольших белков определяется только физико-химическим взаимодействием своих химических групп. Белок не только «знает», какую пространственную конфигурацию принять, но и делает это вполне самостоятельно, без дополнительных агентов.

На образование третичной структуры белка могут влиять его лиганды, а также химическая модификация аминокислот.

Фолдинг крупных молекул имеет свои особенности. Так, крупные молекулы белков с большим молекулярным весом и сложной структурой в процессе фолдинга в условиях высокой концентрации белков в клетке могут взаимодействовать друг с другом, за счет своих реакционно-способных радикалов. Гидрофобные радикалы на поверхности молекул склонны к объединению (агрегации), что нарушает ход их правильного фолдинга. Поэтому на время фолдинга реакционноспособные аминокислотные остатки одних белков должны быть отделены от аминокислотных остатков других белков. Эту функцию выполняют вспомогательные белки . Они связываются с белками, находящимися в неустойчивом, склонном к агрегации, состоянии, стабилизируют их конформацию и обеспечивают их «правильный» фолдинг.

Такие белки называются факторами фолдинга и делятся на две групппы: фолдазы и шапероны .

Биологическая химия Лелевич Владимир Валерьянович

Фолдинг

Фолдинг белков – процесс сворачивания полипептидной цепи в правильную пространственную структуру. При этом происходит сближение удаленных аминокислотных остатков полипептидной цепи, приводящее к формированию нативной структуры. Эта структура обладает уникальной биологической активностью. Поэтому фолдинг является важной стадией преобразования генетической информации в механизмы функционирования клетки.

Структура и функциональная роль шаперонов в фолдинге белков

В процессе синтеза полипептидных цепей, транспорта их через мембраны, при сборке олигомерных белков возникают промежуточные нестабильные конформации, склонные к агрегации. На вновь синтезированном полипептиде имеется множество гидрофобных радикалов, которые в трёхмерной структуре спрятаны внутри молекулы. Поэтому на время формирования нативной конформации реакционноспособные аминокислотные остатки одних белков должны быть отделены от таких же групп других белков.

Во всех известных организмах от прокариотов до высших эукариотов обнаружены белки, способные связываться с белками, находящимися в неустойчивом, склонном к агрегации состоянии. Они способны стабилизировать их конформацию, обеспечивая фолдинг белков. Эти белки получили название шаперонов.

Классификация шаперонов (Ш)

В соответствии с молекулярной массой все шапероны можно разделить на 6 основных групп:

1. высокомолекулярные, с молекулярной массой от 100 до 110 кДа;

2. Ш-90 – с молекулярной массой от 83 до 90 кДа;

3. Ш-70 – с молекулярной массой от 66 до 78 кДа;

6. Низкомолекулярные шапероны с молекулярной массой от 15 до 30 кДа.

Среди шаперонов различают: конститутивные белки (высокий базальный синтез которых не зависит от стрессовых воздействий на клетки организма), и индуцибельные, синтез которых в нормальных условиях идёт слабо, но при стрессовых воздействиях на клетку резко увеличивается. Индуцибельные шапероны относятся к «белкам теплового шока», быстрый синтез которых отмечают практически во всех клетках, которые подвергаются любым стрессовым воздействиям. Название «белки теплового шока» возникло в результате того, что впервые эти белки были обнаружены в клетках, которые подвергались воздействию высокой температуры.

Роль шаперонов в фолдинге белков

При синтезе белков N-концевая область полипептида синтезируется раньше, чем С-концевая область. Для формирования конформации белка нужна его полная аминокислотная последовательность. Поэтому в период синтеза белка на рибосоме защиту реакционно-способных радикалов (особенно гидрофобных) осуществляют Ш-70.

Ш-70 – высококонсервативный класс белков, который присутствует во всех отделах клетки: цитоплазме, ядре, митохондриях.

Фолдинг многих высокомолекулярных белков, имеющих сложную конформацию (например, доменное строение), осуществляется в специальном пространстве, сформированном Ш-60. Ш-60 функционируют в виде олигомерного комплекса, состоящего из 14 субъединиц.

Шапероновый комплекс имеет высокое сродство к белкам, на поверхности которых есть элементы, характерные для несвёрнутых молекул (прежде всего участки, обогащённые гидрофобными радикалами). Попадая в полость шаперонового комплекса, белок связывается с гидрофобными радикалами апикальных участков Ш-60. В специфической среде этой полости, в изоляции от других молекул клетки происходит выбор возможных конформаций белка, пока не будет найдена единственная, энергетически наиболее выгодная конформация.

Высвобождение белка со сформированной нативной конформацией сопровождается гидролизом АТФ в экваториальном домене. Если белок не приобрёл нативной конформации, то он вступает в повторную связь с шапероновым комплексом. Такой шаперонзависимый фолдинг белков требует затрат большего количества энергии.

Таким образом, синтез и фолдинг белков протекает при участии разных групп шаперонов, препятствующих нежелательным взаимодействиям белков с другими молекулами клетки и сопровождающих их до окончательного формирования нативной структуры.

Роль шаперонов в защите белков клеток от денатурирующих стрессовых воздействий

Шапероны, участвующие в защите клеточных белков от денатурирующих воздействий, как уже говорилось выше, относят к белкам теплового шока (БТШ) и в литературе часто обозначают как HSP (англ. heat shock protein).

При действии различных стрессовых факторов (высокая температура, гипоксия, инфекция, УФО, изменение рН среды, изменение молярности среды, действие токсичных химических веществ, тяжёлых металлов и т.д.) в клетках усиливается синтез БТШ. Имея высокое сродство к гидрофобным участкам частично денатурированных белков, они могут препятствовать их полной денатурации и восстанавливать нативную конформацию белков.

Установлено, что кратковременные стрессовые воздействия увеличивают выработку БТШ и повышают устойчивость организма к длительным стрессовым воздействиям. Так, кратковременная ишемия сердечной мышцы в период бега при умеренных тренировках значительно повышает устойчивость миокарда к длительной ишемии. В настоящее время перспективными исследованиями в медицине считают поиски фармакологических и молекулярно-биологических способов активации синтеза БТШ в клетках.

Болезни, связанные с нарушением фолдинга белков

Расчёты показали, что лишь небольшая часть теоретически возможных вариантов полипептидных цепей может принимать одну стабильную пространственную структуру. Большинство же таких белков может принимать множество конформаций с примерно одинаковой энергией Гиббса, но с различными свойствами. Первичная структура большинства известных белков, отобранных эволюцией, обеспечивает исключительную стабильность одной конформации.

Однако некоторые растворимые в воде белки при изменении условий могут приобретать конформацию плохо растворимых, способных к агрегации молекул, образующих в клетках фибриллярные отложения, именуемые амилоидом (от лат. аmylum – крахмал). Так же, как и крахмал, амилоидные отложения выявляют при окраске ткани йодом.

Это может происходить:

1. при гиперпродукции некоторых белков, в результате чего увеличивается их концентрация в клетке;

2. при попадании в клетки или образовании в них белков, способных влиять на конформацию других молекул белка;

3. при активации протеолиза нормальных белков организма, с образованием нерастворимых, склонных к агрегации фрагментов;

4. в результате точечных мутаций в структуре белка.

В результате отложения амилоида в органах и тканях нарушаются структура и функция клеток, наблюдаются их дегенеративные изменения и разрастание соединительнотканных клеток. Развиваются болезни, называемые амилоидозами. Для каждого вида амилоидоза характерен определённый тип амилоида. В настоящее время описано более 15 таких болезней.

После того как пептидная цепь отходит от рибосомы она должна принять свою биологически активную форму, т.е. свернуться определенным образом, связать какие-либо группы и т.п. Реакции превращения полипептида в активный белок называются процессинг или посттрансляционная модификация белков .

Посттрансляционная модификация белков

К основным реакциям процессинга относятся:

1. Удаление с N-конца метионина или даже нескольких аминокислот специфичными аминопептидазами.

2. Образование дисульфидных мостиков между остатками цистеина.

3. Частичный протеолиз – удаление части пептидной цепи, как в случае с инсулином или протеолитическими ферментами ЖКТ.

4. Присоединение химической группы к аминокислотным остаткам белковой цепи:

• фосфорной кислоты – например, фосфорилирование по аминокислотам Серину, Треонину, Тирозину используется при регуляции активности ферментов или для связывания ионов кальция,
• карбоксильной группы – например, при участии витамина К происходит γ-карбоксилирование глутамата в составе протромбина, проконвертина, фактора Стюарта, Кристмаса, что позволяет связывать ионы кальция при инициации свертывания крови,
• метильной группы – например, метилирование аргинина и лизина в составе гистонов используется для регуляции активности генома,
• гидроксильной группы – например, присоединение ОН-группы к лизину и пролину с образованием гидроксипролина и гидроксилизина необходимо для созревания молекул коллагена при участии витамина С ,
• йода – например, в тиреоглобулине присоединение йода необходимо для образования предшественников тиреоидных гормонов йодтиронинов,

5. Включение простетической группы:

• углеводных остатков – например, гликирование требуется при синтезе гликопротеинов.
• гема – например, при синтезе гемоглобина, миоглобина, цитохромов, каталазы,
• витаминных коферментов – биотина, ФАД, пиридоксальфосфата и т.п.

6. Объединение протомеров в единый олигомерный белок, например, гемоглобин, коллаген, лактатдегидрогеназа, креатинкиназа.

Фолдинг белков

Фолдинг – это процесс укладки вытянутой полипептидной цепи в правильную трехмерную пространственную структуру. Для обеспечения фолдинга используется группа вспомогательных белков под названием шапероны (chaperon , франц. – спутник, нянька). Они предотвращают взаимодействие новосинтезированных белков друг с другом, изолируют гидрофобные участки белков от цитоплазмы и "убирают" их внутрь молекулы, правильно располагают белковые домены.

Аминокислотная последовательность не является единственным фактором, определяющим форму белковой молекулы. В клетке существуют специальные молекулы, которые активно участвуют в фолдинге белков.

В совокупности молекулы, участвующие в фолдинге белков, называют регуляторами фолдинга, среди которых выделяют несколько типов. Молекулы, ускоряющие фолдинг, называются катализаторами фолдинга . Молекулы, служащие для изменения формы белка, - шаперонами фолдинга . Существует четыре типа молекул, которые играют роль таких шаперонов .

1. Молекулы, обеспечивающие правильный фолдинг белков (фолдинг-шапероны - folding chaperones).

2. Молекулы, созданные для удержания частично свернутой молекулы белка в определенном положении. Это необходимо, чтобы система имела возможность закончить фолдинг (удерживающие шапероны - holding chaperones).

3. Шапероны, разворачивающие белки с неправильной формой (дезагрегирующие шапероны - disaggregating chaperones).

4. Шапероны, сопровождающие белки, транспортируемые через клеточную мембрану (секреторные шапероны - secretory chaperons).

Фолдинг шапероны помогают белку принять правильную конформацию. Многие из них являются небольшими сахарами или пептидами. Представьте себе сборочную линию на производстве. Пока изделие перемещается по сборочной линии, вы можете вставлять в него некоторые временные приспособления, например скобы и заклепки, чтобы поддерживать определенную форму на протяжении нескольких этапов сборки. По окончании этих этапов удерживающие устройства можно удалить. На следующих этапах сборки вам могут понадобиться дополнительные удерживающие приспособления, которые будут удалены на выходе готового изделия. Небольшие по размеру молекулы фолдинг-шаперонов выступают в роли скоб и заклепок в сборочной линии, поддерживая изделие в правильной конфигурации, необходимой для завершения следующего этапа. Если белки приняли неправильную форму, они не будут выполнять свойственную им функцию или же будут накапливаться в виде нерастворимых агрегатов, известных под названием включений.

Внутри клетки содержится большое количество воды. Молекулы, находящиеся в ней, обычно заряжены, то есть являются гидрофильными. Незаряженные молекулы, как мы помним, гидрофобны. В длинной, линейной последовательности белка имеются гидрофильные участки, а также гидрофобные области. В водной среде клетки гидрофобные поверхности белка стремятся оказаться внутри белковой молекулы, выставляя гидрофильные участки наружу, где они могут взаимодействовать с молекулами воды. Функция небольших молекул фолдинг-шаперонов заключается во взаимодействии с гидрофобными поверхностями белка, заряжая их или, напротив, прикрывая заряженные области, что позволяет белку принять правильную форму. Путем добавления и удаления этих молекул клетка определяет, когда и каким образом гидрофобный участок белка окажется внутри белковой молекулы. Тем самым определяется форма белка (рис. 8.6).

Рис. 8.6. Влияние шаперонов

Удерживающие шапероны связываются с белками, играя роль своеобразного резервуара этих белков до тех пор, пока фолдинг-шапероны не освобождаются и не начинают работу с этими белками. Удерживающие шапероны поддерживают белки в условиях химического и теплового напряжения до тех пор, пока условия внутри клетки не станут более благоприятными для правильного фолдинга белка. Это один из механизмов, который использует клетка для предотвращения неправильного фолдинга. Другой механизм связан с функционированием дезагрегирующих шаперонов. Дезагрегирующие шапероны осуществляют рефолдинг белков, фолдинг которых был выполнен неправильно. Они осуществляют в клетке важную контролирующую функцию по сбору и утилизации вторичного сырья. Несмотря на существование этих механизмов, определенный процент клеточных белков все же попадает в мусорную кучу, то есть образует нерастворимые включения. Включения видны в клетке в виде небольших плотных скоплений.

Одна из характерных черт шаперонов, которую вы нашли бы особенно важной, заключается в том, что они являются относительно неспецифичными. Иными словами, молекула шаперона будет осуществлять фолдинг более чем одного белка. Исследователи, изучающие причины неправильного фолдинга белков, случайно обнаружили в поврежденных клетках молекулы, сходные по структуре с шаперонами. Они нашли молекулы, которые исправляют последствия неправильного фолдинга белков. Исходя из универсальной природы шаперонов, вы можете вводить различные шапероны в биоинженерную систему и влиять на правильный фолдинг белка в среде, где он бы иначе не происходил. Создание специализированных шаперонов, ответственных за фолдинг рекомбинантных (биоинженерных) белков, - очень активно развивающаяся область биоинженерных исследований.

Белок можно подвергнуть фолдингу более одного раза. Представим себе белок, который предназначен для поступления в клеточную мембрану, то есть представляет собой интегральный мембранный белок. Белок образуется в цитоплазме клетки, а затем транспортируется по направлению к плазматической мембране. Такие белки проходят сквозь мембрану, закрепляются в ней и формируют на ее поверхности рецепторную структуру. Для транспорта белка может быть необходима одна его конформация, в то время как непосредственно перед встраиванием в мембрану белок подвергается рефолдингу.

В периплазматическом пространстве, то есть в пространстве между мембраной и оболочкой бактериальной клетки, находятся шапероны, обеспечивающие фолдинг и встраивание в мембрану интегральных мембранных белков. В эукариотических клетках большинство из посттрансляционных изменений белков направлено на их экспорт и встраивание внутрь плазматической мембраны. Такие модификации белков происходят в люмене эндоплазматического ретикулума и аппарате Гольджи. Эти органеллы предназначены для хранения и видоизменения белков.

В секреции белков из клетки участвует другая контролирующая система, которая включает секреторные шапероны . Секреторные шапероны узнают сигнальную последовательность аминокислот, которую соответственно называют секреторной последовательностью. Эта последовательность связывается с секреторным шапероном, шаперон поступает внутрь мембраны, обеспечивая экспорт белка вместе с собой.

Потрясающую игру разработали учёные из Вашингтонского университета (США). Программа под названием Fold.it представляет собой модель сворачивания белков в трёхмерные конструкции. Геймер должен попытаться сделать это наиболее удачным образом. В программу будут загружаться реальные данные о настоящих, только что изобретённых протеинах, которые непонятно как сворачиваются. Результаты отправятся через интернет в центр обработки, где их проверят на суперкомпьютере (это будет с осени, а пока что в программу заложены уже решённые загадки, так что сейчас она выполняет роль тренажёра).

В самом деле, все геймеры нашего мира тратят миллиарды человеко-часов на бесполезные для человечества игры типа WoW, Counter-Strike или пасьянса «Косынка». В то же время они могли бы использовать интеллект более эффективно: например, сворачивая белки на экране своего монитора. Это ведь тоже по-своему интересно.

Один из разработчиков игры, профессор биохимии Дэвид Бейкер, искренне верит, что где-то в мире живут таланты, у которых есть врождённая способность просчитывать в уме 3D-модели протеинов. Какой-нибудь 12-летний мальчик из Индонезии увидит игру и сможет решить задачи, которые не под силу даже суперкомпьютеру. Кто знает, может, такие люди действительно есть?

Каждый протеин (в человеческом теле их более 100 000 видов) представляет собой длинную молекулу. Предсказать, в какую замысловатую форму свернётся эта молекула в тех или иных условиях (и способна ли она вообще свернуться в какую-либо устойчивую форму) - задача высшей степени сложности. Компьютерное моделирование представляет собой ресурсоёмкий процесс, но в то же время критически важный в фармацевтике. Ведь не зная формы белка невозможно смоделировать его свойства. Если же эти свойства являются полезными, то протеины можно синтезировать и на их базе сделать новые эффективные препараты, например, для лечения рака или СПИДа (Нобелевская премия гарантирована в обоих случаях).

В настоящее время над обсчитыванием модели каждой новой молекулы белка трудятся сотни тысяч компьютеров в распределённой вычислительной сети , однако ученые из Вашингтонского университета предлагают другой способ: не тупой перебор всех вариантов, а интеллектуальный мозговой штурм через компьютерную игру. Количество вариантов сокращается на порядок, а суперкомпьютер гораздо быстрее найдёт правильные параметры фолдинга.

В трёхмерную «развлекалку» Fold.it могут играть все: даже дети и секретарши, которые понятия не имеют о молекулярной биологии. Разработчики постарались сделать такую игру, чтобы она была интересна каждому. А результат игры вполне может стать основой для Нобелевской премии и спасти жизни тысяч людей.

Программа выпущена в версиях под Win и Mac. Дистрибутив размером 53 МБ можно