ВходМетоды посева и культивирования бактерий. Чашечный метод коха Метод коха микробиология выделение чистых культур
Метод Пастера Метод Коха Биологический Физический
(имеет историческое (пластинчатых
значение) разводок) Химический Метод Щукевича
Современные
Посев петлей Посев шпателем
(Метод Дригальского)
Методы выделения чистых культур (схема 11):
1. Методы механического разобщения основаны на разъединении микробов путем последовательного растирания исследуемого материала по поверхности агара.
а) Метод Пастера – имеет историческое значение, предусматривает последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде методом переката
б) Метод Коха – метод пластинчатых разводок – основан на последовательном разведении исследуемого материала мясо-пептонным агаром с последующей разливкой пробирок с разведенным материалом в чашки Петри
в) Метод Дригальского – при посеве материала, обильно обсемененного микрофлорой, используют 2–3 чашки для последовательного посева шпателем.
г) Посев петлей параллельными штрихами .
2. Биологические методы основаны на биологических свойствах возбудителей.
а) Биологический – заражение высокочувствительных животных, где микробы быстро размножаются и накапливаются. В одних случаях, этот метод является единственным, позволяющим выделить культуру возбудителя от больного человека (например, при туляремии),в других случаях – он более чувствителен (например, выделение пневмококка на белых мышах или возбудителя туберкулеза на морских свинках).
б) Химический
– основан на кислотоустойчивости микобактерий. Для освобождения материала от сопутствующей флоры, его
обрабатывают раствором кислоты. Вырастут только туберкулезные палочки, так как кислотоподатливые микробы погибли под действием кислоты.
в) Физический метод
основан на устойчивости спор к нагреванию. Для выделения культуры спорообразующих бактерий из
смеси материал прогревают при 80°С и засевают на питательную среду. Вырастут только споровые бактерии, так как споры их остались живыми и дали рост.
г) Метод Щукевича – основан на высокой подвижности вульгарного протея, способного давать ползучий рост.
Методика пересева из колоний на скошенный агар и МПБ:
а) Пересев из колоний на скошенный агар
Приоткрывают крышку чашки, прокаленной остуженной петлей снимают часть отдельной колонии, открывают пробирку со стерильным скошенным агаром, держа ее в левой руке в наклонном положении, так, чтобы можно было наблюдать поверхность среды. Переносят петлю с культурой в пробирку, не прикасаясь к стенкам, растирают по питательной среде, скользя по поверхности от одного края пробирки к другому, поднимая штрихи до верхушки среды – посев штрихом. Пробирку закрывают и, не выпуская из рук, подписывают название посеянного микроба и дату посева.
б) Пересев из колонии на мясо-пептонный бульон
Техника пересева на МПБ в основном такая же, как и при посеве на плотную среду. При посеве на МПБ петлю с находящимся на ней материалом погружают в среду. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый стерильной пастеровской или градуированной пипеткой, вливают в питательную среду.
В результате самостоятельной работы студент должен знать:
1. Методы выделения чистой культуры микроорганизмов
2. Методы культивирования микроорганизмов
Уметь:
1. Навыки соблюдения правил противоэпидемического режима и техники безопасности
2. Обеззараживать материал, проводить обработку рук
3. Приготовить препараты из колоний бактерий
4. Микроскопировать колоний
5. Окрашивать по Граму микроорганизмы
ЗАНЯТИЕ 8
ТЕМА. Методы выделения чистых культур (продолжение). Ферментативная активность бактерий и методы ее изучения.
широко используется для определения количества жизнеспособных микроорганизмов в почве и других естественных субстратах. Применение его позволяет не только учесть численность микроорганизмов, но и оценить их разнообразие по морфологии колоний.
Почвенные образцы берут с помощью стерильной ложки, исследование проводится в день взятия образцов. Сущность метода заключается в высеве исследуемой пробы почвы на плотную среду в чашки Петри и последующем подсчете выросших колоний. При этом считают, что каждая колония является результатом размножения одной клетки. Работа проводится в три приема: приготовление разведений, посев в чашки, подсчет выросших колоний.
Посев делают из разведений суспензии в зависимости от предполага- мого количества микроорганизмов в исследуемом субстрате. Разведения делают в стерильной водопроводной воде или изотоническом растворе хлористого натрия. В ходе опыта используют постоянный коэффициент разведения. Чаще всего делают десятичные разведения.
Образец анализируемой почвы (1-10 г) помещают в колбу со 100 мл стерильной воды и встряхивают. Затем переносят стерильной пипеткой 1 мл исследуемого материала в пробирку с 9 мл стерильной воды. Если исследуемый материал уже был разведен в 100 раз, получают разведение 1:1000. Суспензию этого разведения тщательно перемешивают, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Затем этой же пипеткой берут 1 мл полученного разведения и переносят его во вторую пробирку - получают разведение 1:10000. Таким же образом готовят и последующие разведения. Степень разведения устанавливается предполагаемым количеством микроорганизмов в образце: число разведений тем больше, чем больше микроорганизмов в исходном субстрате.
Посев производят на агаризованные среды в чашки Петри. Для определения суммарной численности микроорганизмов используют мясопептонный или рыбопептонный агар (МПА, РПА), для определения содержания грибов в почве - сусло-агар (СА), для определения численности различных физиологических групп и санитарно-показательных микроорганизмов используют соответствующие питательные среды. В стерильные чашки Петри наливают расплавленную на водяной бане агаризованную среду, по 20-30 мл в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока не застынет агар. Стерильной пипеткой наносят определенный объем (обычно 0,1-0,5 мл) соответствующего разведения, предварительно тщательно перемешанного, на поверхность агаровой пластинки в чашку Петри. Данный объем распределяют по поверхности среды стерильным шпателем. Затем этим шпателем проводят по всей поверхности среды во второй и третьей чашке, куда посевной материал не вносили (метод истощающего посева).
Из каждого разведения делают 4-6 параллельных высевов. При параллельных посевах одного разведения можно пользоваться одной стерильной пипеткой и одним шпателем. Чашки с засеянными средами помещают в термостат, отрегулированный на температуру, благоприятную для развития выявляемых организмов. Подсчет бактерий производят при культивировании с температурой 30 °С через трое суток, при комнатной температуре - через семь суток. Подсчет дрожжей и грибов - при комнатной температуре через 310 суток (при температуре 25 °С срок наблюдения за грибами может быть сокращен до 2-3 дней).
Подсчитывают количество колоний, выросших в чашке Петри, и делают пересчет на 1 г. Результаты параллельных высевов суммируют и вычисляют среднее число колоний, выросших при высеве из этого разведения. Колонии считают, не открывая чашки Петри.
Точность метода зависит от числа подсчитанных колоний, а не от числа повторностей. Лучшим разведением считают то, при высеве из которого на плотной питательной среде от 50 до 100 колоний. Если число выросших колоний меньше 10, то эти результаты отбрасывают и для расчета количества клеток в исходном субстрате не используют. Желательно, чтобы общее количество подсчитанных колоний при высеве из данного разведения было не менее 300.
Количество микроорганизмов в 1 г (1 мл) исходного субстрата вычисляют по формуле:
T = a x b x c / d,
где T - количество микроорганизмов в 1 г, a - количество подсчитанных колоний, b - разведение, из которого произведен высев, c - 10 (если на чашки высевали 0,1 мл суспензии), d - масса субстрата (почвы), взятого для анализа
Статистическая обработка результатов возможна только при минимальной технической ошибке, поэтому чашечный метод требует большой чистоты и аккуратности при выполнении всех операций. Необходимо тщательно оберегать пипетки и среды от заражения посторонними микроорганизмами, так как случайно попавшая клетка может завысить число микроорганизмов в исследуемой суспензии. Приготовление разведений и высевы следует производить в боксе.
Описанный метод применим для учета аэробов и факультативных анаэробов. Для учета строгих анаэробов чашки Петри после посева помещают в анаэробные условия.
Экологические методы исследования почвенных микроорганизмов
Для выделения бактерий в виде чистых культур известно сравнительно мало методов. Чаще всего это делают путем изолирования отдельных клеток на твердой питательной среде, используя метод посева штрихом или разлива по чашкам небольшого количества жидкой культуры (метод предельных разведений ). Однако получение отдельной колонии не всегда гарантирует чистоту культуры, поскольку колонии могут вырасти не только из отдельных клеток, но и из их скоплений. Если микроорганизмы образуют слизь, то часто к ней прикрепляются посторонние формы. Для очистки предпочтительно использовать неселективную среду (МПА), поскольку на ней лучше растут контаминирующие микроорганизмы и их легче обнаружить.
Получение изолированных колоний на твердой питательной среде достигается либо путем рассева взвеси микроорганизмов шпателем (метод Коха ), либо с помощью бактериологической петли (метод истощающего штриха ). В результате механического разобщения клеток микроорганизмов каждая из них может дать начало изолированной колонии одного вида микробов.
Рассев шпателем (метод Коха) производят в следующей последовательности:
1) на поверхность питательной среды в чашке № 1 наносят стерильной пипеткой каплю накопительной культуры и распределяют ее стерильным шпателем;
2) шпатель достают, чашку быстро закрывают и переносят шпатель в чашку № 2, не стерилизуя его. Имитируют распределение культуры по всей поверхности среды, прикасаясь к ее поверхности той же стороной шпателя, которой ранее распределяли пробу;
3) точно те же действия проводят и в чашке № 3, после чего шпатель стерилизуют;
4) засеянные чашки помещают в термостат и инкубируют при оптимальной температуре.
Через определенное время чашки достают из термостата и изучают рост микроорганизмов. Обычно в чашке № 1 наблюдают сплошной рост бактерий, в последующих чашках отмечают колонии.
Рассев петлей (метод истощающего штриха) предполагает высев бактериологической петлей из накопительной культуры на поверхность агаризованной среды в чашках Петри. На первом этапе петлей с культурой наносят ряд параллельных штрихов на агаризованной среде (рисунок 4.2, А ). Петлю стерилизуют, остужают о незасеянную часть агаризованной среды и проводят серию штрихов в направлении, перпендикулярном первым (рисунок 4.2, Б ). Затем петлю вновь стерилизуют, остужают и штрихи наносят в направлении В (рисунок 4.2), а после очередной стерилизации – в направлении Г (рисунок 4.2). Чашки помещают в термостат и через определенное время учитывают результаты. Обычно на штрихах А и Б вырастает большое число колоний (иногда сплошной рост), тогда как на штрихах В и Г формируются изолированные колонии.
Рисунок 4.2 – Схема рассева бактерий штрихами для получения изолированных колоний
Последовательные разведения в твердой среде – самый простой способ посева по чашкам, который заключается в том, что после инокуляции пробы в пробирку со стерильным расплавленным и охлажденным агаром, среду перемешивают, выливают в чашку Петри и дают ей застыть. Для получения хорошо изолированных колоний готовят ряд последовательных десятикратных разведений и по 1 мл проб вносят сразу в чашку, добавляют 15–20 мл расплавленной агаризованной среды и смешивают, покачивая чашку. Иногда отдельные колонии оказываются погруженными в агар и извлечь их можно только механически. Плохо и то, что бактерии некоторое время находятся в среде при температуре расплавленного агара.
8. Методы выделения чистых культур микроорганизмов
Культивирование микроорганизмов, помимо состава питательной среды, сильно зависит от физических и химических факторов (температура, кислотность, аэрация, свет и т. д.). При этом количественные показатели каждого из них неодинаковы и определяются особенностями метаболизма каждой группы бактерий. Существуют методы культивирования микроорганизмов на твердых и в жидких питательных средах в аэробных, анаэробных и других условиях.
Методы выделения чистых культур аэробных микроорганизмов. Для того, чтобы получить изолированные колонии, при нанесении материал распределяют так, чтобы клетки бактерий были удалены друг от друга. Для получения чистой культуры используют две основные группы методов:
а) методы, основанные на принципе механического разделения микроорганизмов;
б) методы, основанные на биологических свойствах микроорганизмов.
Методы, основанные на принципе механического разделения микроорганизмов
Рассев шпателем по Дригальскому . Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлей или пипеткой наносят каплю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель переносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом производят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й - минимальное. В зависимости от содержания микробных клеток в исследуемом материале на одной из чашек вырастают отдельные колонии, пригодные для выделения чистой культуры микроорганизма.
Метод Пастера (метод разведений). Из исследуемого материала готовят ряд последовательных, чаще десятикратных серийных разведений в жидкой стерильной среде или физиологическом растворе в пробирках. Далее высевают материал газоном по 1 мл из каждой пробирки. Предполагают, что в какой-то из пробирок останется количество микроорганизмов, поддающихся подсчету при высеве на пластинчатые среды. Этот метод дает возможность подсчитать микробное число в исследуемом материале. (Микробное число - количество колоний на последней чашке с ростом микроорганизмов, умноженное на степень разведения материала).
Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды Метод Коха (метод заливок). Исследуемый материал в небольшом количестве вносят в пробирку с расплавленным и охлажденным до 45-50°С МПА, перемешивают, затем каплю питательной среды с разведенным материалом переносят во вторую пробирку с расплавленным МПА и т.д. Количество разведений зависит от предполагаемой численности микроорганизмов в исследуемом материале. Приготовленные разведения микробов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам пробирок. После застудневания среды с исследуемым материалом чашки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала.
Рассев петлей (посев штрихами). Берут одну чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора, проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки. Исследуемый материал петлей вносят в первый сектор и проводят ею параллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлей, не изменяя ее положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток вырастают отдельные колонии. Кроме того, можно наливать разведенные растворы смешанной культуры на поверхность твердых сред в чашках.
Метод фильтрации. Основан на пропускании исследуемого материала через специальные фильтры с определенным диаметром пор и разделении содержащихся микроорганизмов по величине. Этот метод применяется главным образом для очистки вирусов от бактерий, а также при получении фагов и токсинов (в фильтрате - чистый фаг, очищенный токсин).
Методы, основанные на биологических свойствах микроорганизмов
Создание оптимальных условий для размножения
Создание оптимального температурного режима для избирательного подавления размножения сопутствующей микрофлоры при низкой температуре и получения культур психрофильных или термофильных бактерий. Большинство микробов неплохо развиваются при 35-37°С, иерсинии хорошо растут при 22°С, лептоспиры культивируют при 30°С. Термофильные бактерии растут при температурах, лежащих за пределами температурных режимов прочих сопутствующих видов бактерий (так, кампилобактер культивируют при 42°С).
Создание условий для аэробиоза или анаэробиоза. Большинство микроорганизмов хорошо растут в присутствии атмосферного кислорода. Облигатные анаэробы растут в условиях, исключающих присутствие атмосферного кислорода (возбудители столбняка, ботулизма, бифидумбактерии, бактероиды и др.). Микроаэрофильные микроорганизмы растут только при низком содержании кислорода и повышенном содержании СО 2 (кампилобактер, геликобактер).
Метод обогащения. Исследуемый материал засевают на элективные питательные среды, способствующие росту определенного вида микроорганизмов.
Метод Шукевича. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются по агару, как бы «вползают» на его поверхность. Отсевая верхние края культуры в конденсационную воду свежескошенного агара и повторяя это несколько раз, можно получить чистую культуру. Так, для выделения культуры Proteus vulgaris, Clostridium tetani материал засевают в конденсационную воду на дне пробирки со скошенной плотной средой, не касаясь поверхности среды. Названные микроорганизмы способны давать ползучий рост (роение) на поверхности среды. Сопутствующие микробы растут в нижней части питательной среды, а протей и столбнячный микроб в виде пленки распространяются вверх и занимают всю скошенную часть агара.
Метод прогревания. Позволяет отделить спорообразующие бациллы от неспоровых форм. Прогревают исследуемый материал на водяной бане при 80°С 10-15 мин. При этом погибают вегетативные формы, а споры сохраняются и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают.
Бактериостатический метод (метод ингибирования). Основан на различном действии некоторых химических веществ и антибиотиков на микроорганизмы. Определенные вещества угнетают рост одних микроорганизмов и не оказывают влияния на другие. Например, небольшие концентрации пенициллина задерживают рост грамположительных микроорганизмов и не влияют на грамотрицательные. Смесь пенициллина и стрептомицина позволяет освободить нитчатые грибы и дрожжи от бактериальной флоры. Серная кислота (5% раствор) быстро убивает большинство микроорганизмов, а туберкулезная палочка выживает в этих условиях. Необходимо учитывать, что селективные факторы часто включены в состав среды в бактериостатических концентрациях, поэтому сопутствующие микрооорганизмы остаются жизнеспособными и при переносе колоний исследуемой культуры на обычные среды могут быть причиной получения смешанной культуры.