Главная / Истории успеха / Применение тандемноймасс-спектрометрии (вэжх-мсмс)в клинической диагностике. Применение тандемноймасс-спектрометрии (вэжх-мсмс)в клинической диагностике Текст научной работы на тему «Вэжх-мс-методика анализа липидных профилей сыворотки крови морских свино

Применение тандемноймасс-спектрометрии (вэжх-мсмс)в клинической диагностике. Применение тандемноймасс-спектрометрии (вэжх-мсмс)в клинической диагностике Текст научной работы на тему «Вэжх-мс-методика анализа липидных профилей сыворотки крови морских свино

Для идентификации и количественного определения нового аминокислотного производного 1,3,4-тиадиазола ЛХТ7-09 был разработан валидированный метод ВЭЖХ-МС/МС. Максимальная чувствительность масс-спектрометрического детектирования ЛХТ7-09 была достигнута в режиме регистрации положительных ионов при напряжении электроспрея 5500 В и потенциале декластеризации 36 В. Выявленные MRM-переходы подтвердили химическую структуру нового аминокислотного производного 1,3,4-тиадиазола. Для эффективного выделения ЛХТ7-09 из многокомпонентных смесей тиадиазолиламидов разработан градиентный режим высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием в качестве элюента смеси ацетонитрила и деионизированной воды в разных соотношениях. Для данных условий хроматографии определено время удерживания соединения ЛХТ7-09, равное 11 минутам. Для количественного определения соединения ЛХТ7-09 разработано градуировочное решение зависимости площади хроматографического пика от концентрации раствора.

вэжх-мс/мс

хроматография

масс-спектрометрия

тиадиазол

1. Казаишвили Ю.Г., Попов Н.С. Исследование противоспалительной активности новых производных тиадиазола при формалиновом отеке лапы у крыс / Ю.Г. Казаишвили, Н.С. Попов // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 3. www..

2. Новые производные тиадиазола, обладающие противогрибковой активностью / А.С. Кошевенко [и др.] // Успехи медицинской микологии. – 2015. – Т. 14. – С. 348-351.

3. Синтез и противоопухолевая активность новых фурил-2-замещенных 1,3,4-тиадиазолов, 1,2,4-триазолов / Т.Р. Овсепян [и др.] // Химико-фармацевтический журнал. – 2011.– Т. 45. – № 12. – С. 3-7.

4. Попов Н.С., Демидова М.А. Оценка острой токсичности нового аминокислотного производного тиадиазола при внутрибрюшинном введении мышам / Н.С. Попов, М.А. Демидова // Верхневолжский медицинский журнал. – 2016. – Т. 15, вып. 1. – С. 9-12.

5. Попов Н.С., Демидова М.А. Оценка ульцерогенности нового аминокислотного производного тиадиазола при внутрижелудочном введении крысам / Н.С. Попов, М.А. Демидова // Врач-аспирант. – 2017. – № 1(80). – С. 71-78.

6. Синтез и противомикробная активность амидов фенилтио- и бензилсульфонилуксусных кислот на основе 2-амино-5-алкил(арилалкил)-1,3,4-тиадиазолов / С.А. Серков [и др.] // Химико-фармацевтический журнал. – 2014. – Т. 48, № 1. – С. 24-25.

7. Arpit K., Basavaraj M., Sarala P., Sujeet K., Satyaprakash K. Synthesis and pharmacological activity of imidazothiadiazole derivatives // Acta Poloniae Pharmaceutica, Drug Research. 2016. Vol. 73. No. 4. P. 937-947.

8. Eman M. Flefel, Wael A. El-Sayed, Ashraf M. Mohamed Synthesis and Anticancer Activity of New 1-Thia-4-azaspirodecane, Their Derived Thiazolopyrimidine and 1,3,4-Thiadiazole Thioglycosides // Molecules. 2017. No. 22 (1). P. 170.

9. Jorge R.A. Diaz, Gerardo Enrique Cami. Salts of 5-amino-2-sulfonamide-1,3,4-thiadiazole, a structural and analog of acetazolamide, show interesting carbonic anhydrase inhibitory properties, diuretic, and anticonvulsant action // Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 2016. Vol. 12. No. 6. P. 1102-1110.

10. Naiyuan Chen, Wengui D., Guishan L., Luzhi L. Synthesis and antifungal activity of dehydroabietic acid-based 1,3,4-thiadiazole-thiazolidinone compounds // Molecular Diversity. 2016. Vol. 20. No. 4. P. 897-905.

11. Yomna, I. El-Gazzar, Hanan H. Georgey, Shahenda M. El-Messery. Synthesis, biological evaluation and molecular modeling study of new (1,2,4-triazole or 1,3,4-thiadiazole)-methylthio-derivatives of quinazolin-4(3H)-one as DHFR inhibitors // Bioorganic Chemistry. 2017. Vol. 72. P. 282-292.

Высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектрометрическим детектированием является одним из наиболее перспективных методов для идентификации и количественного определения лекарственных веществ в различных биологических объектах. Метод отличается высокой специфичностью, точностью и возможностью определения веществ в минимальных концентрациях, что позволяет использовать его для количественного определения лекарственных веществ при проведении фармакокинетических исследований и лекарственного мониторинга, что является значимым для клинической лабораторной диагностики. С этой целью необходима разработка и валидация методик количественного определения различных лекарственных веществ, в том числе инновационных, на основе ВЭЖХ-МС/МС-метода.

Оригинальным лекарственным веществом из группы нестероидных противовоспалительных средств является ацексазоламид - новое производное амида 1,3,4-тиадиазола и ацексамовой кислоты. Существенным преимуществом данного соединения является невысокая токсичность и низкая ульцерогенность . Для проведения фармакокинетических исследований и оценки биодоступности данного лекарственного вещества при различных путях введения необходима разработка надежной методики его количественного определения в биологических жидкостях.

Целью настоящего исследования явилась разработка методики идентификации и количественного определения нового нестероидного противовоспалительного средства из группы производных тиадиазола с помощью ВЭЖХ-МС/МС.

Материалы и методы

Объектом исследования явилось новое производное тиадиазола с лабораторным шифром ЛХТ 7-09 , синтезированное в ОАО «ВНЦ БАВ» (г. Старая Купавна) проф. С.Я. Скачиловой (рис. 1).

2-(5-этил-1,3,4-тиадиазолил)амид 2-ацетиламиногексановой кислоты

Рис. 1. Химическая структура ЛХТ 7-09 (брутто формула: С 12 Н 20 N 4 О 2 S ; молярная масса 284,4 г/моль)

Соединение ЛХТ 7-09 по внешнему виду представляет собой порошок белого цвета, который практически не растворим в воде, растворим в спирте, легко растворим в ацетонитриле.

Для идентификации и количественного определения ЛХТ 7-09 использовали валидированный метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС).

Хроматографию осуществляли с помощью высокоэффективного жидкостного хроматографаAgilent 1260 InfinityII(AgilentTechnologies, ФРГ). В исследовании использовали аналитическую колонку AgilentPoroshell 120 EC-C18 2,7 мкм 2,1×10 мм. Для выделения исследуемого соединения нами был разработан градиентный режим хроматографии. В качестве элюента применяли ацетонитрил, воду деионизированную и аммония ацетат в различных соотношениях.

Для масс-спектрометрии использовали тройной квадрупольный масс-спектрометр ABSciexQTrap 3200 MD(ABSciex, Сингапур) с электрораспылительным источником ионов (TurboV с зондом TurboIonSpray). Калибровку масс-спектрометра проводили с помощью тестового раствора резерпина в концентрации 6,1×10 -2 мг/л.

Масс-спектрометрический анализ исследуемых образцов проводили в режиме электрораспыления при прямом вводе образца и элюата, подаваемого хроматографом. Прямой ввод исследуемых образцов в масс-хроматограф осуществляли с помощью шприцевого насоса диаметром 4,61 мм со скоростью 10 мкл/мин.

При разработке методики идентификации и количественного определения нового производного тиадиазола подбирали оптимальные условия высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-детектирования. Учитывали время выхода вещества из хроматографической колонки и MRM-переход (осуществляли регистрациюm /z иона-предшественника на первом аналитическом квадруполе Q1 и m /z ионов-продуктов на втором аналитическом квадруполе Q3). Для количественного определения ЛХТ 7-09 проводили построение калибровочного графика в диапазоне концентраций от 0,397 до 397 нг/мл.

В качестве программного обеспечения использовали AnalystMD 1.6.2.Software (ABSciex).

Результаты и обсуждение

На первом этапе экспериментального исследования осуществляли масс-детектирование исследуемого образца путем его прямого ввода в масс-детектор с помощью шприцевого насоса. На этапе пробоподготовки получали раствор ЛХТ 7-09 (500 нг/мл) в смеси ацетонитрила и воды ионизированной в соотношении 2:1 с добавлением аммония ацетата (0,1%).

Предварительные эксперименты показали, что в режиме регистрации положительных ионов чувствительность определения ЛХТ 7-09 была выше, а масс-спектр интенсивнее и информативнее, чем в режиме регистрации отрицательных ионов. В связи с этим в дальнейших исследованиях использовали только режим положительной ионизации.

Для получения интенсивного пика были подобраны следующие условия масс-детектирования: положительная поляризация, напряжение электроспрея 5500,0 В, потенциал декластеризации и потенциал ввода - соответственно 36,0 и 6,5 В при давлении газа завесы 20,0 psi и газа распыления 40,0 psi, скорость 10 мкл/мин. Диапазон сканирования составлял 270-300 Да.

Анализ полученного масс-спектрана первом аналитическом квадруполе Q1 показал, что в данных условиях за счет присоединения протона водорода образуется протонированная молекула исследованного соединения + со значением m / z 285,2 Да (рис. 2).

Рис. 2. Масс-спектр протонированной молекулы ЛХТ 7-09 (в режиме сканирования положительных ионов +)

На втором аналитическом квадруполе Q3 осуществляли регистрацию ионов-продуктов для иона-предшественника со значением m/z 285,2 Да. Анализ масс-спектра 2 порядка показал наличие множества пиков, из которых 3 были наиболее интенсивными - m/z 114,2 Дa, m/z 130,2 Дa и m/z 75,1 Дa (рис. 3).

Рис. 3. Масс-спектр ионов-продуктов (в режиме сканирования положительных ионов, ион-предшественник m / z 285,2 Да)

Для получения ионного сигнала высокой интенсивности были подобраны оптимальные значения энергии в ячейке соударения Q2 (рассмотрен диапазон энергий от 0 до 400 В). Для ионов-продуктов со значениями m / z 114,2 Дa, 130,2 Дa и 75,1 Дaоптимальная энергия в соударительной ячейке составила соответственно 27 В; 23 В и 49 В.

Предполагается, что ион-продукт со значением m / z 114,2 Дa является фрагментом 5-амино-2-этил-1,3,4-тиадиазола, так как при фрагментации других производных 1,3,4-тиадиазола также выявляется ион-продукт с таким же значением m / z . Ион-продукт со значением m / z 130,2 Да, вероятно, является протонированным фрагментом ацексамовой кислоты. Таким образом, результаты проведенного масс-детектирования исследуемого образца подтвердили химическую структуру нового производного 1,3,4-тиадиазола.

На следующем этапе экспериментального исследования осуществляли анализ исследуемого соединения методом ВЭЖХ-масс-спектрометрии.

В режиме ВЭЖХ-МС/МС использовали следующие условия ионизации: напряжение электроспрея 5500,0 В, скорость потока подвижной фазы 400 мкл/мин, температура азота 400 °С, давление газа завесы и распыляющего потока 20,0 и 50,0 psi соответственно. Скорость регистрации единичных масс-спектров составила 100 спектров в секунду. Для получения суммированного масс-спектра на хроматограмме выделяли временной промежуток 10,5-11,5 мин; по интенсивности сигнала ионов-продуктов строили кривые временной зависимости ионного тока и площади пиков отдельных сигналов, соответствующих исследуемому соединению. Объем вводимой пробы в аналитическую колонку составил 10 мкл.

Для выделения исследуемого соединения был использован градиентный режим высокоэффективной жидкостной хроматографии, который обеспечивался изменением состава элюента на входе в аналитическую колонку. В качестве элюента применяли ацетонитрил, воду деионизированную и аммония ацетат в различных соотношениях. Выбор градиентного режима хроматографии был связан с тем, что в условиях изократического режима элюирования (в том числе при использовании разных концентраций ацетонитрила) не удавалось получить пик исследуемого вещества симметричной формы с пригодным для анализа временем удерживания. По данным проведенного исследования оптимальным был следующий режим подачи элюента: с 0 до 4 мин концентрация ацетонитрила 1%; с 4 по 8 мин линейное увеличение концентрации ацетонитрила до 99 %; с 8 по 12 минуту - изократический участок (1% ацетонитрила). По завершении исследования осуществляли промывку хроматографической колонки 30 % раствором ацетонитрила в течение 5 минут.

При использовании описанного режима хроматографии для исследованного соединения был получен симметричный пик достаточной интенсивности (рис. 4).

Рис. 4. Хроматограмма ЛХТ 7-09 (аналитическая колонка Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 мкм 2,1×10 мм; градиентный режим хроматографии)

Анализ полученных хроматограмм для растворов ЛХТ 7-09 разной концентрации показал, что время удерживания (tR) при данных условиях элюирования составило 11 минут и не зависело от концентрации исследуемого вещества. В связи с этим значение времени удерживания можно использовать в качестве дополнительного критерия подтверждения подлинности ЛХТ 7-09 в составе многокомпонентных смесей. Обращает на себя внимание тот факт, что данные параметры хроматографии можно использовать для идентификации ЛХТ 7-09 не только с помощью масс-детектора, но и других детекторов, в том числе фотометрического.

Для количественного определения нового производного тиадиазола осуществляли построение калибровочного графика в диапазоне концентраций от 0,397 нг/мл до 397 нг/мл (рис. 5).

Рис. 5. Калибровочный график для определения концентрацииЛХТ 7-09 (по оси абсцисс - концентрация ЛХТ 7-09 в нг/мл, по оси ординат - площадь пика в импульсах)

Для разработки градуировочного решения использовали растворы ЛХТ 7-09 в концентрациях 0,397; 1,980; 3,970; 19,8; 39,7; 198,0; 397,0 нг/мл. Зависимость площади пика от концентрации исследованного соединения описывалось следующим уравнением регрессии:

y= 8,9e 5 ·x 0,499 , значение коэффициента регрессии составило r=0,9936.

Следует отметить, что разработанное градуировочное решение позволяет с высокой точностью осуществлять количественное определение исследованного соединения в широком диапазоне концентраций, что позволяет использовать данный метод для оценки качества лекарственного вещества и для проведения фармакокинетических исследований.

Таким образом, результатом проведенного исследования явилась разработка метода идентификации и количественного определения нового аминокислотного производного тиадиазола с помощью ВЭЖХ-МС/МС.

Выводы

ВЭЖХ-МС/МС позволяет с высокой точностью осуществлять идентификацию и количественное определение нового аминокислотного производного тиадиазола.
Масс-детектирование нового производного тиадиазола ЛХТ 7-09 целесообразно проводить в режиме сканирования положительных ионов (МRM-переход - ион-предшественник Q1 m / z 285,2 Да; ионы-продукты Q3m / z 114,2 Дa, m / z 130,2 Дa и m / z 75,1 Дa).
Для выделения ЛХТ 7-09 из многокомпонентных смесей разработана методика высокоэффективной жидкостной хроматографии (аналитическая колонка Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 мкм 2,1×10 мм; элюент ацетонитрил: вода деионизированная: аммония ацетат; градиентный режим).

Библиографическая ссылка

Попов Н.С., Малыгин А.С., Демидова М.А. РАЗРАБОТКА ВЭЖХ-МС/МС-МЕТОДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ НОВОГО ПРОИЗВОДНОГО ТИАДИАЗОЛА // Современные проблемы науки и образования. – 2017. – № 5.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=26988 (дата обращения: 01.02.2020). Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»

Ключевые слова

СТЕРОИДЫ / ЛИПИДЫ / СЫВОРОТКА КРОВИ / МЕТАБОЛИЧЕСКИЙ ПРОФИЛЬ / ПРОМЫШЛЕННЫЕ ОТХОДЫ / STEROIDS / LIPIDS / BLOOD SERUM / METABOLIC PROFILE / INDUSTRIAL WASTES

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы - Чаховский Павел Анатольевич, Янцевич Алексей Викторович, Дмитроченко Алеся Егоровна, Иванчик Александр Викторович

Воздействие антропогенных факторов оказывает многостороннее влияние на организм человека и животных. В связи с их комплексным воздействием выявление негативных эффектов отдельных факторов представляет собой довольно сложную задачу. Метаболомная методология, позволяющая преодолеть указанные сложности, была применена при оценке характера и степени влияния отходов производства калийных удобрений на липидные профили экспериментальных животных при интраназальной затравке отходами производства калийных удобрений и потреблении питьевой воды, полученной из источников, расположенных в зоне потенциального действия калийного производства. Выделение липидов из сыворотки проводили с помощью специально разработанной методики, основанной на твердофазной экстракции, позволяющей удалить из образцов холестерин. Каждый образец был подвергнут анализу методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической детекцией (ВЭЖХ-МС), после чего полученные хроматограммы обрабатывали с использованием метода главных компонент (МГК) и кластерного анализа. Разработанная методика позволяет эффективно разделять гидрофобные метаболиты в сыворотке крови . Установлен липидный профиль сыворотки крови опытных животных, в частности содержание фосфолипидов и оксистероидов, и обнаружены различия в метаболических процессах между опытными и контрольными животными. В сыворотке крови экспериментальных животных была повышена по сравнению с контрольной группой концентрация оксистероидов.

ANALYSIS OF SERUM LIPID PROFILES IN GUINEA PIGS FOR EARLY DETECTION OF CHANGES IN METABOLISM UNDER EXPOSURE TO ENVIRONMENTAL CONTAMINANTS

The exposure to anthropogenic factors has a multifaceted impact on the body of humans and animals. Due to their complex influence the detection of negative effects of the certain factors is a rather complicated task. Metabolomic methodology which permits to overcome these difficulties, has been applied in the evaluation of the nature and degree of the impact of potash fertilizers production waste on lipid profiles of experimental animals after intranasal inoculation with potassic fertilizer production waste and consumption of drinking water obtained from sources located in the zone of potential action of potassic fertilizer production. Isolation of lipids from serum was performed with the help of specially developed technique based on solid-phase extraction of samples which allows to remove cholesterin from the samples. Each sample was subjected to HPLC-MS analysis, after which the obtained chromatograms were treated with the use of the method of principal component analysis and cluster analysis. The developed technique allows to efficiently separate hydrophobic metabolites in blood serum . There was established serum lipid profile of experimental animals, in particular the content of phospholipids and oxysteroids, and there were found differences in the metabolic processes of the test and control animals. It is shown that in the serum of experimental animals, there is observed an increased concentration of hydroxysteroid as compared with the control group,.

Текст научной работы на тему «Вэжх-мс-методика анализа липидных профилей сыворотки крови морских свинок для выявления ранних изменений метаболизма при воздействии загрязнителей окружающей среды»

[гиена и санитария 3/2014

Чаховский П.А.1, Янцевич А.В.2, Дмитроченко А.Е.2, Иванчик А.В.2

ВЭЖХ-МС-МЕТОДИКА АНАЛИЗА ЛИПИДНЫХ ПРОФИЛЕЙ СЫВОРОТКИ КРОВИ

морских свинок для выявления ранних изменений метаболизма при воздействии загрязнителей окружающей среды

ТУ «Республиканский научно-практический центр гигиены», 220012, г. Минск, Республика Беларусь; ^Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси, 220141, г. Минск, Республика Беларусь

Воздействие антропогенных факторов оказывает многостороннее влияние на организм человека и животных. В связи с их комплексным воздействием выявление негативных эффектов отдельных факторов представляет собой довольно сложную задачу. Метаболомная методология, позволяющая преодолеть указанные сложности, была применена при оценке характера и степени влияния отходов производства калийных удобрений на липидные профили экспериментальных животных при интраназальной затравке отходами производства калийных удобрений и потреблении питьевой воды, полученной из источников, расположенных в зоне потенциального действия калийного производства. Выделение липидов из сыворотки проводили с помощью специально разработанной методики, основанной на твердофазной экстракции, позволяющей удалить из образцов холестерин. Каждый образец был подвергнут анализу методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической детекцией (ВЭЖХ-МС), после чего полученные хроматограммы обрабатывали с использованием метода главных компонент (МГК) и кластерного анализа. Разработанная методика позволяет эффективно разделять гидрофобные метаболиты в сыворотке крови. Установлен липидный профиль сыворотки крови опытных животных, в частности содержание фосфолипидов и оксисте-роидов, и обнаружены различия в метаболических процессах между опытными и контрольными животными. В сыворотке крови экспериментальных животных была повышена по сравнению с контрольной группой концентрация оксистероидов.

Ключевые слова: стероиды; липиды; сыворотка крови; метаболический профиль; промышленные отходы.

P. A. Chakhovskiy1, A.V Yantsevich2, A. E. Dmitrochenko2, A. V. Ivanchik2 - ANALYSIS OF SERUM LIPID PROFILES IN GUINEA PIGS FOR EARLY DETECTION OF CHANGES IN METABOLISM UNDER EXPOSURE TO ENVIRONMENTAL CONTAMINANTS

1The Republican Scientific and Practical Centre of Hygiene, Minsk, Republic of Belarus, 220012; 2The Institute of Bioorganic Chemistry, Minsk, Republic of Belarus, 220141

для корреспонденции: Чаховский Павел Анатольевич, chahovsky@gmail . com

The exposure to anthropogenic factors has a multifaceted impact on the body of humans and animals. Due to their complex influence the detection of negative effects of the certain factors is a rather complicated task. Metabolomic methodology which permits to overcome these difficulties, has been applied in the evaluation of the nature and degree of the impact of potash fertilizers production waste on lipid profiles of experimental animals after intranasal inoculation with potassic fertilizer production waste and consumption of drinking water obtainedfrom sources located in the zone ofpotential action ofpotassic fertilizer production. Isolation of lipids from serum was performed with the help of specially developed technique based on solid-phase extraction of samples which allows to remove cholesterin from the samples. Each sample was subjected to HPLC -MS analysis, after which the obtained chromatograms were treated with the use of the method of principal component analysis and cluster analysis. The developed technique allows to efficiently separate hydrophobic metabolites in blood serum. There was established serum lipid profile of experimental animals, in particular the content of phospholipids and oxysteroids, and there were found differences in the metabolic processes of the test and control animals. It is shown that in the serum of experimental animals, there is observed an increased concentration of hydroxysteroid as compared with the control group,.

Key words: steroids, lipids, blood serum, metabolic profile, industrial wastes.

Введение

Одна из важнейших задач системной биологии и функциональной генетики - интегрирование данных протеомики, транскриптомики и информации о метаболических процессах, происходящих в организме. Любое заболевание либо патологический процесс, протекающий в организме, отражается на содержании низкомолекулярных метаболитов в тканях и крови. Для интегральной характеристики низкомолекулярных метаболитов плазмы крови в 1971 г. был введен термин «метаболический профиль» . Поскольку одновременный анализ нескольких классов метаболитов чрезвычайно сложен и практически нереализуем, для изучения метаболических профилей обычно используют серию методов, включая ядерномагнитно-резонансную (ЯМР) спектроскопию высокого разрешения и хромато-масс-спектрометрию .

Как правило, при проведении метаболомных исследований ограничиваются определенной группой веществ, отделяемых от других компонентов при пробоподготовке. Получаемые при этом групповые данные легче интерпретировать.

Метаболические профили (в частности, мочи и плазмы крови) могут быть использованы для определения характера физиологических изменений, вызванных поступлением в организм токсичных соединений . Во многих случаях наблюдаемые изменения могут дать дополнительную характеристику специфических поражений, например печени и жировой ткани.

Анализ содержания стероидов и липидов в сыворотке крови обладает большим диагностическим потенциалом . Липидный состав сыворотки крови, стероидные гормоны, их предшественники и продукты их метаболических превращений характеризуют множество функциональных параметров организма. Эти вещества играют важную координирующую роль в регуляции метаболизма и сердечно-сосудистой функции, участвуют в ответе организма на острый и хронический стресс.

Стероидный профиль является уникальным диагностическим критерием ряда гинекологических и онкологических заболеваний, связанных с нарушением синтеза и метаболизма стероидных гормонов, при этом некоторые из них могут быть диагностированы только по стероидному профилю . В профильном анализе весьма значима возможность использования абсолютных величин как простых переменных и сравнения их с нормой. Однако изменение соотношения величин может быть более важным. Кроме того, стероидный профиль дает информацию о большом количестве стероидов одновременно.

Определение стероидного профиля сыворотки крови - эффективный метод выявления почти всех нарушений метаболизма стероидов, который позволяет поставить

точный диагноз во многих клинических ситуациях, например при врожденной гиперплазии коры надпочечников, гиперальдостеронизме I типа, первичном гиперальдостеронизме, болезни Иценко-Кушинга, недостаточности надпочечников и др. Стероидный профиль важен при диагностике нарушений половой дифферен-цировки и функции половых желез, а также гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой недостаточности .

Избыточное поступление соли, являющейся превалирующим компонентом отходов калийных удобрений, в организм экспериментальных крыс с избыточной массой тела приводит к излишней активации синтеза альдо-стерона и вызывает гипертензию и поражение почек с метаболическим синдромом .

В регионах промышленного производства с высокой степенью контаминации окружающей среды уровень заболеваемости населения, как правило, выше, чем в относительно «чистых» регионах. Объектом наших исследований был выбран г. Солигорск, расположенный в зоне масштабной добычи и переработки калийных руд. В районах солеотвалов и шламохранилищ калийных комбинатов образовалась зона хлоридно-натриевого засоления, которая охватывает подземные воды на глубину более 100 м, что может влиять на загрязнение источников питьевого водоснабжения и атмосферного воздуха.

Для оценки влияния загрязнения отдельных компонентов окружающей среды в регионе промышленного производства калийных удобрений нами проведен анализ липидных профилей сыворотки крови как индикатора ранних метаболических нарушений под влиянием смеси химических веществ.

Цель работы - выявление метаболических изменений у лабораторных животных при экспозиции к отходам производства калийных удобрений и потреблении питьевой воды, полученной из источников, потенциально подвергнутых влиянию отходов производства, с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической детекцией (ВЭЖХ-МС).

Объектом исследования являлась сыворотка крови экспериментальных животных (морских свинок) опытной и контрольной групп.

Материалы и методы

Экспериментальные исследования проведены на 35 морских свинках (17 самок и 18 самцов) массой тела 305-347 г.

[гиена и санитария 3/2014

Опытная группа (затравка отходами промышленного производства калийных удобрений и питьевой водой из системы водоснабжения г. Солигорска), 20 особей (10 самок и 10 самцов);

Контрольная группа (затравка изотоническим раствором хлорида натрия для исключения результатов влияния стрессового фактора, вызванного процедурой затравки), 15 особей (8 самцов и 7 самок).

При проведении эксперимента ежедневно наблюдали за общим состоянием животных, потреблением корма и воды.

Для моделирования хронического ингаляционного воздействия (12 нед) отходов производства калийных удобрений руководствовались МУ.№11-11-10-2002 «Требования к постановке токсиколого-аллергологических исследований при гигиеническом нормировании белоксодержащих аэрозолей в воздухе рабочей зоны», включая определение затравочной дозы. Образцы из солеотвалов растирали в мраморной ступке до однородного пылеобразного состояния, растворяли в дистиллированной воде до необходимой концентрации с учетом массы тела экспериментальных животных (массу тела контролировали еженедельно для корректировки дозы). Расчетные дозы составили: на начало эксперимента -2,028 мг/0,1 см3, через 4 нед - 2,85 мг/0,1 см3, через 6 нед - 3,17 мг/0,1 см3, через 8 нед и до конца эксперимента 3,8 мг/0,1 см3 .

Морскую свинку без наркотизации фиксировали в положении на спине с приподнятой головой, пипеточ-ным дозатором вводили поочередно в ноздри (дробно) дозу теплого раствора (в течение 2-3 мин) таким образом, чтобы исключить чихание. Возникающие «хлюпающие» звуки подтверждали проникновение раствора в дыхательные пути.

Опытная группа животных «вдыхала» смесь ежедневно однократно 5 дней в неделю в течение 12 нед. Животные контрольной группы «вдыхали» физиологический раствор (0,9% NaCl).

Для отбора биологического материала животных наркотизировали (эфирный наркоз), после декапитации собирали кровь. Сыворотку получали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин, хранили при -20 С для дальнейших исследований. В сыворотке крови анализировали фосфолипиды, оксистероиды, жирные кислоты.

Пробоподготовка. К сыворотке крови добавляли внутренний стандарт - прогестерон до достижения концентрации 10-5 М (10 мкл на 1 мл образца). Затем для осаждения белков, содержащихся в образце, и экстракции стероидов добавляли метанол до конечной концентрации 70% (на 1 мл образца 2,33 мл метанола) с последующим центрифугированием в течение 15 мин при 10 000 g. Белки, содержащиеся в образце, образовывали при этом плотный осадок. Супернатант отделяли от осадка и пропускали через предварительно кондиционированную колонку для твердофазной экстракции (ТФЭ-колонка), содержащую 100 мг октадецилсилильного силикагеля. ТФЭ-колонку кондиционировали последовательным пропусканием 2 мл метанола, 2 мл воды и 2 мл 70% метанола. В первой стадии с колонкой связывается холестерин, содержание которого в плазме крови и других биологических жидкостях достаточно велико, а также ряд других высокогидрофобных липидов. После связывания холестерина колонку дополнительно промывали 2 мл 70% метанола. При высоком содержании холестерина в образце или большом объеме образца ис-

пользовали ТФЭ-колонку с большим содержанием сорбента. Элюаты объединяли и выпаривали. Выпаривание осуществляли при 50°С в струе инертного газа. Сухой остаток растворяли в 500 мкл метанола и центрифугировали в течение 10 мин при 10 000 g. При этом оседали полярные, нерастворимые в метаноле соединения. Супернанант отделяли от осадка и разбавляли водой до концентрации метанола 10%. Полученный раствор пропускали через предварительно кондиционированную ТФЭ-колонку (пропускали 2 мл метанола, 2 мл воды и 2 мл 10% метанола) и промывали 2 мл 10% метанола. Связавшиеся с колонкой стероиды элюировали 3 мл 80% метанола. Раствор выпаривали и сухой остаток растворяли в 100 мкл метанола. Полученный раствор анализировали с использованием ВЭЖХ-МС.

ВЭЖХ анализ. Анализ проводили на хроматографе Accela, оснащенном масс-спектрометрическим детектором LCQ-Fleet. Разделение выполняли на колонке Cosmosil 5C18-MS-II с геометрическими параметрами 4,6*150 мм («Nacalai Tesque», Япония).

Программа разделения (растворитель А - вода, растворитель В - метанол, скорость потока 500 мкл/мин): в течение 5 мин 60% В, 12 мин - линейный градиент 60-95% В, 10 мин - 95% В, 8 мин - линейный градиент 95-100% В, 5 мин - 100% В, 5 мин - 60% В.

Для масс-спектрометрического анализа использовали источник химической ионизации при атмосферном давлении (APCI). Параметры источника ионизации: температура испарителя - 350°C, поток осушающего газа - 35 ед., поток вспомогательного газа - 5 ед., температура капилляра - 275°С, напряжение на капилляре - 18 В, напряжение на ионном объективе - 80 В. Использовали режим сканирований, зависимых от данных (Data Dependent™), с применением ионной ловушки в диапазоне сканирования 50-1000 m/z.

Хроматограммы, полученные с помощью масс-спектрометрического детектора в режиме химической ионизации (полный ионный ток), переводили в текстовый формат с использованием программы Qual Browser из пакета Xcalibur (“Thermo Sci”, США). Полученную информацию обрабатывали с применением реализованного в пакете Statistica 10 метода главных компонент и инструментов для кластерного анализа и построения дендрограмм. Для расшифровки масс-спектров и идентификации индивидуальных соединений использовали справочник .

Результаты и обсуждение

В качестве исходной методики для адаптации применяли метод твердофазной экстракции стероидов из сыворотки и плазмы крови, описанный в руководстве фирмы «Macherey-Nagel” Solid phase extraction. Application guide, которое содержит рекомендации по применению колонок для твердофазной экстракции. Адаптированная методика пробоподготовки с твердофазной экстракцией позволила эффективно выделить фосфолипиды, окси-стероиды и жирные кислоты из сыворотки крови морских свинок.

Описанная методика хроматографического разделения дает возможность эффективно разделять как стероидные гормоны, так и липиды, присуствующие в сыворотке.

Согласно описанным методикам проведен анализ образцов. На рис. 1 (см. 2-ю полосу обложки) для примера приведены наложенные хроматограммы, полученные при анализе 3 образцов из опытной группы (выделены

Рис. 4. Масс-спектры вещества со временем удерживания 21,5 мин: а - химическая ионизация при атмосферном давлении в отрицательном режиме; б - химическая ионизация при атмосферном давлении в положительном режиме.

красным цветом) и 3 образцов из контрольной группы (выделены синим цветом). Аналогичная картина наблюдалась и в других случаях.

Для обработки указанных массивов данных применили метод главных компонент (МГК) и кластерный анализ, который позволил выявить различия липидных профилей между контрольной и опытной группами. МГК-график 1-й и 2-й главных компонент, полученных

при понижении размерности данных, представлен на рис. 2 (см. 2-ю полосу обложки). На графике легко заметить, что точки объединяются в 2 группы, локализованные соответственно в 1, 4 и 2, 3 квадрантах. При этом точки, соответствующие опытным образцам, преимущественно попадают в 1 и 4 квадрант, точки, соответствующие контрольным образцам, локализованы во 2 и 3 квадрантах. Дендрограмма, полученная при кла-

[гиена и санитария 3/2014

Идентификация присутствующих на хроматограмме пиков

Время удерживания, мин Основные пики в "+"-режиме Основные пики в "-"-режиме

19,15 393,7 446,8

448,7 493,5 623,4 524,4

19,35 87 227 271 335,5 353,3 371,2 389.1 448.2 493.3 405,4

21,50 316,1 390,0

430.3 448.4 779,1

23,8 319.4 391,6 429.5 783,2

24,35 414,8 448,8

31,73 313,3 330,9

33,9 231.5 245.5 263,3 281,1 295.1 305.2 371.3 521.0 663.1 279,4

Вещество

Фосфатидилхолин

Арахиновая кислота

Фосфатидная кислота 42:4

Арахиновая и докозате-траеновая кислоты

Докозапентаеновая

Линолевая кислота

Дигидроксихолестерин

стерном анализе, приведена на рис. 3. Таким образом, статистический анализ хроматографических данных свидетельствует о различиях метаболических процессов, протекающих в организмах экспериментальных животных, относящихся к контрольной и опытной группам.

Для выявления конкретных метаболических изменений были расшифрованы масс-спектры и идентифи-

цированы индивидуальные соединения (см. таблицу). Недостаточный для анализа объем образца не позволил обнаружить изменения профиля стероидных гормонов в сыворотке. Однако липиды с промежуточной полярностью детектировались на хроматограмме.

Индивидуальные соединения идентифицировали посредством анализа масс-спектров веществ, записанных при различных режимах ионизации. Так, масс-спектр вещества в двух режимах ионизации со временем удерживания 21,5 мин представлен на рис. 4. Анализ данного спектра показал, что вещество является диацил-sn-глицерофосфатом с молекулярной массой 780 (R1(311) = 20:0 жирная кислота (арахиновая), R2(331) = 22:4 жирная кислота (докозатетраеновая)).

Установлено, что хроматографический пик со временем удерживания 42,52 мин соответствует диги-дроксихолестерину, предположительно одному из предшественников в биосинтезе желчных кислот. Различия в содержании оксистероидов в сыворотке крови свидетельствует о возможном нарушении метаболизма желчных кислот. Можно заметить, что на хроматограммах, представленных на рис. 1, в сыворотке крови экспериментальных животных наблюдается повышенная по сравнению с контрольной концентрация оксистеро-идов (пики со временем удерживания 35-45 мин).

заключение. Использованная в работе методика позволяет с высокой степенью эффективности выявлять ранние нарушения липидного обмена при воздействии поллютантов окружающей среды. Полученные результаты свидетельствуют о том, что интраназаль-ное введение водных растворов солевых отвалов экспериментальным животным Cavia porcellus приводит к изменению метаболизма липидов и оксистероидов. В частности, наблюдаемое повышенное содержание предшественников желчных кислот (оксистероидов) у животных может быть связано с нарушением функции печени и ферментов, участвующих в биосинтезе желчных кислот. Таким образом, описанный подход может быть использован для выявления нарушений метаболизма липидов у жителей регионов с техногенным загрязнением.

Литер атура

1. Horning E.C., Horning M.G. Metabolic profiles: gas-phase methods for analysis of metabolites . Clin. Chem. 1971; 17(8): 802-9.

2. Constantinou M.A., Tsantili-Kakoulidou A., Andreadou I., Iliodro-mitis E.K., Kremastinos D.T., Mikros E. Application of NMR-based metabonomics in the investigation of myocardial ischemia-reperfusion, ischemic preconditioning and antioxidant intervention in rabbits . Eur. J. Pharm. Sci. 2007; 30(3-4): 303-14.

3. Lu W., Bennett B.D., Rabinowitz J.D. Analytical strategies for LC-MS-based targeted metabolomics. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2008; 871(2): 236-42.

4. Novotny M.V, Soini H.A., Mechref Y. Biochemical individuality reflected in chromatographic, electrophoretic and mass-spectro-metric profiles. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2008; 866(1-2): 26-47.

5. German J.B., Gillies L.A., Smilowitz J.T., Zivkovic A.M., Watkins S.M. Lipidomics and lipid profiling in metabolomics. Curr. Opin. Lipidol. 2007; 18(1): 66-71.

6. Schwarz E., Liu A., Randall H., Haslip C., Keune F., Murray M. et al. Use of steroid profiling by UPLC-MS/MS as a second tier test in newborn screening for congenital adrenal hyperplasia: the Utah experience. Pediatr. Res. 2009; 66(2): 230-5.

7. Rauh M. Steroid measurement with LC-MS/MS. Application

К ст. Чаховского и соавт.

Рис. 3. Дендрограмма, построенная на основании кластерного анализа и иллюстрирующая кластеризацию образцов по группам.

К ст. Чаховского и соавт.

Рис. 1. Совмещенные хроматограммы образцов 1-3 из контрольной группы (выделено красным цветом) и 15-17 из опытной группы (выделено синим цветом).

Projection of the cases on the factor-plane (1 x 2) Cases with sum of cosine square >= 0.00

18/3 9/з 21/1 ■ О

1 заем " Ш о 28/1 " 22/10 41 /1 п

Factor 1: 65.71%

Рис. 2. График, полученный путем обработки хроматограмм с помощью МГК. Контрольная группа выделена синим цветом, опытная - красным.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) – это метод колоночной хроматографии, в котором подвижной фазой (ПФ) служит жидкость, движущаяся через хроматографическую колонку, заполненную неподвижной фазой (сорбентом). Колонки для ВЭЖХ характеризуются высоким гидравлическим давлением на входе в колонку, поэтому ВЭЖХ иногда называют «жидкостной хроматографией высокого давления».

В зависимости от механизма разделения веществ различают следующие варианты ВЭЖХ: адсорбционную, распределительную, ионообменную, эксклюзионную, хиральную и др.

В адсорбционной хроматографии разделение веществ происходит за счет их различной способности адсорбироваться и десорбироваться с поверхности адсорбента с развитой поверхностью, например, силикагеля.

В распределительной ВЭЖХ разделение происходит за счет различия коэффициентов распределения разделяемых веществ между неподвижной (как правило, химически привитой к поверхности неподвижного носителя) и подвижной фазами.

По полярности ПФ и НФ ВЭЖХ разделяют на нормально-фазовую и обращенно-фазовую.

Нормально-фазовым называют вариант хроматографии, в котором используются полярный сорбент (например, силикагель или силикагель с привитыми NH 2 - или CN-группами) и неполярная ПФ (например, гексан с различными добавками). В обращенно-фазовом варианте хроматографии используют неполярные химически модифицированные сорбенты (например, неполярный алкильный радикал C 18) и полярные подвижные фазы (например, метанол, ацетонитрил).

В ионообменной хроматографии молекулы веществ смеси, диссоциировавшие в растворе на катионы и анионы, разделяются при движении через сорбент (катионит или анионит) за счет их разной скорости обмена с ионными группами сорбента.

В эксклюзионной (ситовой, гель-проникающей, гель-фильтрационной) хроматографии молекулы веществ разделяются по размеру за счет их разной способности проникать в поры неподвижной фазы. При этом первыми из колонки выходят наиболее крупные молекулы (с наибольшей молекулярной массой), способные проникать в минимальное число пор неподвижной фазы, а последними выходят вещества с малыми размерами молекул.

часто разделение протекает не по одному, а по нескольким механизмам одновременно.

Метод ВЭЖХ может применяться для контроля качества любых негазообразных анализируемых веществ. Для проведения анализа используют соответствующие приборы – жидкостные хроматографы.

В состав жидкостного хроматографа обычно входят следующие основные узлы:

– узел подготовки ПФ, включая емкость с подвижной фазой (или емкости с отдельными растворителями, входящими в состав подвижной фазы) и систему дегазации ПФ;

– насосная система;

– смеситель подвижной фазы (при необходимости);

– система ввода пробы (инжектор);

– хроматографическая колонка (может быть установлена в термостате);

– детектор;

– система сбора и обработки данных.

Насосная система

Насосы обеспечивают подачу ПФ в колонку с заданной постоянной скоростью. Состав подвижной фазы может быть постоянным или меняющимся во время анализа. В первом случае процесс называют изократическим, а во втором – градиентным. Перед насосной системой иногда устанавливают фильтры с диаметром пор 0,45 мкм для фильтрации подвижной фазы. Современная насосная система жидкостного хроматографа состоит из одного или нескольких насосов, управляемых компьютером. Это позволяет менять состав ПФ по определенной программе при градиентном элюировании. Смешение компонентов ПФ в смесителе может происходить как при низком давлении (до насосов), так и при высоком давлении (после насосов). Смеситель можно использовать для подготовки ПФ и при изократическом элюировании, однако более точное соотношение компонентов достигается при предварительном смешении компонентов ПФ для изократического процесса. Насосы для аналитической ВЭЖХ позволяют поддерживать постоянную скорость подачи ПФ в колонку в интервале от 0,1 до 10 мл/мин при давлении на входе в колонку до 50 МПа. Целесообразно, однако, чтобы это значение не превышало 20 МПа. Пульсации давления минимизируются специальными демпферными системами, входящими в конструкцию насосов. Рабочие детали насосов изготавливаются из коррозионностойких материалов, что позволяет использовать в составе ПФ агрессивные компоненты.

Библиографическая ссылка

ANALYSIS OF SERUM LIPID PROFILES IN GUINEA PIGS FOR EARLY DETECTION OF CHANGES IN METABOLISM UNDER EXPOSURE TO ENVIRONMENTAL CONTAMINANTS

Насосная система

Восстановление пароля